大豆异黄酮（soybean isoflavones，ISO）是大豆中重要的非营养素成分，它主要包括以糖苷结合形式存在的金雀异黄素（genistin）和大豆苷（daidzin）。大豆经加工、微生物发酵或体外酸水解作用，金雀异黄素苷和大豆苷的糖苷部分脱离，释放出游离形式的三羟基异黄酮（金雀异黄素，genistein）和二羟基异黄酮（大豆苷元daidzein），这两种形式的异黄酮可被肠道有效吸收.研究发现ISO具有抗癌作用,对人结肠癌细胞株、前列腺癌细胞株等具有体外抗肿瘤作用，是一种潜在的肿瘤化学预防剂，具有广阔开发应用前景。本文以人乳腺癌MCF-7细胞株作为离体实验模型，探讨ISO对MCF-7细胞的生长抑制、凋亡诱导作用及可能机制。
一、材料与方法
１．材料
（1）细胞培养 MCF-7细胞引自北京市肿瘤研究所；细胞培养于DMEM（Gibco公司）培养基中，含10%灭活小牛血清，100kμ/L青霉素、100mg/L链霉素，置37℃、5%CO2孵箱中培养。
（2）药物处理 大豆异黄酮单体金雀异黄素购自Sigma公司，纯度为98%。用二甲基亚砜（DMSO）将金雀异黄素配成浓度为4
g/L的储备液，然后用DMEM培养液稀释至所需浓度。DMSO在各组培养液中的终浓度为0.5％。
（3）主要试剂 免疫组化检测S-P试剂盒。
２．方法
（1）MTT试验对数生长期MCF-7细胞接种于96孔培养板，每孔5×103个，培养 24h后，加入ISO使终浓度分别为1.25、2.5、5.0、10.0、20.0mg/L，每1浓度设4个平行孔，另设空白对照组，分别培养1、2、3、4、5、6、7d加入5g/L MTT，再培养4h后倒尽板中的培养液，各孔加150μL DMSO，轻轻振动后用酶标仪（波长490nm）测定各孔的光密度（OD）值，以每组4个孔OD的平均值作为各组得平均OD值。
（2）3H-TdR掺入法 常规培养细胞。将MCF-7接种于96孔板内，每孔5×103个细胞，每组6个平行孔。培养24h后加入不同剂量的ISO,继续培养12h、36h，加入3H-TdR，终浓度0.5uci/孔，再培养12h后，用细胞收集仪将细胞收集至玻璃滤膜，液闪计数仪测定CPM值。
（3）透射电镜观察 细胞经ISO 0、20mg/L处理48h，EDT胰蛋白酶消化，磷酸缓冲液洗涤，细胞经25g/L戊二醛前固定，1%锇酸后固定，己醇脱水，树脂包埋，超薄切片，铀铅双重染色，透射电镜下观察。
（4）免疫组化 金雀异黄素处理MCF-7细胞48h后,收集细胞,石蜡包埋。石蜡包片脱水、抗原修复后与1：50稀释的兔抗人Bax、iNOS多克隆抗体在4℃孵育过夜。再用S-P法进行检测，DAB显色，最后以甲基绿复染。阳性信号为棕黄色。
（5）RNA提取RT-PCR 按Trizol试剂盒方法提取不同浓度金雀异黄素处理的MCF-7细胞总RNA，紫外分光光度法测定RNA的纯度与浓度，保存于无水乙醇中，－20℃备用。
取上述提取的4μg RNA为模板，采用AMV 逆转录DNA聚合酶（大连宝公司）逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板扩增iNOS片段。所用引物序列为：
5， GGGTTGGGGTGTGTGGTGATT 3， (上游)
5， TCCGAGGCAAACAGCACATTCA 3，(下游)
片断为462bp。扩增条件为：94℃变性60s，57℃退火60s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min，样品在4℃中结束反应，样品进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
3．统计方法
两组均数差别显著性采用t检验，两样本率比较用Ｘ２检验，用统计软件systat分析。
二、结 果
1． MTT法试验结果
ISO对雌激素受体阳性ER（+）MCF-7细胞生长有抑制作用，随药物浓度增加，细胞增值率下降，呈剂量－效应关系。药物浓度达到5mg/L时，细胞停止生长。
2． 3H-TdR掺入实验
可观察到不同剂量Gen对人乳腺细胞3H-TdR掺入均有抑制作用，且随剂量增加、时间延长抑制作用增强。给药24h 20mg/L Gen组与对照组抑制作用有显著差异（p<0.05）。给药48h后各剂量组与对照组相比，抑制作用均有显著差异（p<0.01）。
3． 光镜和透射电镜观察
倒置显微镜下，人乳腺细胞MCF-7细胞呈多角形，加不同浓度ISO后，细胞生长明显受抑制，增值速度减慢。细胞由多角形逐渐变成圆形，细胞体积变小，附壁疏松。透射电镜观察，可见染色质浓缩、集聚，聚集细胞周边，细胞膜表面突起消失，细胞浆空泡化,呈典型的凋亡细胞的形态学改变。
4． 免疫组化结果
Bax、iNOS阳性物质呈棕黄色颗粒状，位于MCF-7细胞浆中。经20mg/L Gen处理48h的实验组与对照组相比，Bax、iNOS蛋白表达增加，差异显著（p<0.05），表明Gen有明显上调MCF-7细胞Bax、iNOS表达作用。
5． Gen对MCF-7细胞iNOSmRNA表达的影响
RT-PCR分析发现，Gen对MCF-7细胞iNOS基因转录水平几乎没有什么影响
三．讨论
豆制品中富含的雌激素金雀异黄素是近年来受到食品科学界广泛关注的非营养素成分。动物实验结果表明金雀异黄素有较强的抗癌效应。体外实验证实金雀异黄素有抑制肿瘤细胞增殖的作用，这一作用是通过诱导细胞凋亡实现的。诱导凋亡是各种抗癌药物发挥作用的共同通路，药物诱导凋亡是当前肿瘤研究热点之一。
本研究结果显示Gen对ER（+）MCF-7细胞生长有抑制作用。通过3H-TdR掺入实验发现，Gen抑制人乳腺细胞的DNA合成，随剂量增加、时间延长抑制作用增强。Gen处理人乳腺细胞MCF-7细胞降低细胞克隆形成能力，细胞呈明显凋亡状态，流式细胞仪分析显示G1期前面出现低于二倍体的凋亡峰，Gen引起MCF-7细胞的凋亡。
细胞凋亡调控失调会导致肿瘤的发生。Bax是目前白细胞基因文库中发现的一种新基因，其转录产物Bax可与bc1-2蛋白形成异源二聚体，具有抑制bc1-2功能，促进细胞凋亡作用。本研究发现Gen处理后MCF-7细胞Bax蛋白表达明显增加，表明其有可能参与了诱导MCF-7细胞凋亡。
NO在肿瘤发生中的作用日益受到关注。近年来有学者提出NO具有杀肿瘤作用。NO杀肿瘤作用与其诱导凋有关。本研究显示MCF-7细胞经Gen处理后iNOS基因在蛋白水平的表达增加，但在mRNA水平表达无明显变化。Gen对iNOS蛋白影响可能是其引起MCF-7细胞恶性逆转，走向凋亡的原因之一。INOS在蛋白水平和mRNA水平表达不一致，需作进一步研究。
总之，本研究表明Gen 抑制人乳腺癌细胞MCF-7生长，〔通过上调Bax 、iNOS基因表达诱导乳腺癌细胞凋亡，〕为深入认清Gen抗癌作用及作用机制积累了资料。
